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Tutte le sfide della diagnostica biofotonica

Martedì, 27 Giugno 2017

È la biofotonica il terreno di studio e lavoro del gruppo guidato da Francesco Baldini e che opera presso l’Istituto di fisica applicata "Nello Carrara" (IFAC) del CNR, a Sesto Fiorentino.

Abbiamo intervistato il dottor Baldini per parlare dei progetti “in cantiere” e di quelli che hanno già ottenuto risultati importanti.

Progettazione e sviluppo di sensori ottici per la rilevazione di parametri chimici e biochimici; sviluppo di una piattaforma point of care (POCT) per la misura di immunosoppressori in pazienti trapiantati e di una per la misura di biomarcatori della sepsi in pazienti in terapia intensiva, progettazione e sviluppo di sonde fluorescenti che permettono di monitorare ciò che avviene all’interno di una cellula. È la biofotonica il terreno di studio e lavoro del gruppo guidato da Francesco Baldini e che opera presso l’Istituto di fisica applicata "Nello Carrara" (IFAC) del CNR, a Sesto Fiorentino. Abbiamo intervistato il dottor Baldini per parlare dei progetti “in cantiere” e di quelli che hanno già ottenuto risultati importanti.

Come spiegherebbe, in poche parole, qual è il lavoro che svolge il vostro gruppo e in che settori specifici siete impegnati?
Il gruppo nasce agli inizi degli anni Novanta ed è cresciuto e maturato nel corso degli anni occupandosi fin da subito della rivelazione mediante metodologie ottiche di parametri sia di interesse biomedicale che ambientale. Negli ultimi dieci/quindici anni l’attività del gruppo si è focalizzata soprattutto sulle applicazioni mediche. Diagnostica biofotonica è l’espressione che meglio definisce l’aspetto operativo del gruppo, che è principalmente focalizzato sullo sviluppo di dispositivi in grado di misurare parametri di interesse clinico spesso essenziali ai medici per la formulazione di una corretta diagnosi. Uno degli aspetti peculiari del gruppo è costituito dal fatto che l’attività non si limita alla “proof of concept” del sensore/dispositivo ma spesso prosegue nella caratterizzazione, verifica e validazione in ambiente clinico. Essenziale in questo caso è da una parte il continuo contatto con i medici che diventano i principali referenti della nostra attività, e, dall’altra, l’avere sempre in mente, nella progettazione e nello sviluppo del sensore quelli che sono i requisiti che devono essere soddisfatti per una sua reale utilizzazione in ambiente clinico. Emblematico è il caso del sensore di reflusso biliare nell’apparato gastroesofageo, ideato, brevettato e sviluppato agli inizi degli anni Novanta sulla base di richieste specifiche provenienti dal gruppo del Prof.Paolo Bechi dell’allora Clinica Chirurgica 3 dell’Università di Firenze e validato clinicamente in stretta collaborazione con i medici: il gruppo, curando in prima persona il trasferimento del know-how alla ditta fiorentina Cecchi srl, ha consentito la realizzazione di uno strumento commerciale distribuito per molti anni dalla multinazionale Medtronic e attualmente presente sul mercato commercializzato da EBNeuro. L’attenzione in questi ultimi anni si è concentrata sullo sviluppo dei cosiddetti dispositivi Point of Care Testing” (POCT) (letteralmente test vicino al punto di cura), dispositivi cioè in grado di effettuare vicino al letto del paziente misure veloci ed affidabili di parametri clinici tali da permettere la formulazione di una diagnosi rapida e affidabile e/o la scelta della terapia più idonea, evitando di ricorrere alle analisi di laboratori centralizzati e di attendere alcune ore e talvolta un’intera giornata per ottenere i risultati, un’attesa che si può spesso rivelare esiziale per una pronta guarigione del paziente.

La multidisciplinarità è uno degli elementi che vi caratterizza. Quali sono le professionalità impegnate nei vari progetti?
Il nostro è un gruppo attualmente di sette persone che comprende due fisici, due laureati in chimica e tecnologie farmaceutiche, due ingegneri e una chimica ed è affiancato spesso per periodi di tempo più o meno lunghi, generalmente qualche mese, da ricercatori provenienti sia da paesi della Comunità europea che da fuori Europa. Questa caratteristica garantisce al gruppo di poter affrontare con le giuste competenze tutte le problematiche estremamente multidisciplinari che sono alla base della progettazione, sviluppo e caratterizzazione di sensori e piattaforme sensoristiche di tipo ottico per la rivelazione di parametri chimici e biochimici.

Uno dei fronti sui quali siete stati più impegnati è Nanodem, il progetto europeo per lo sviluppo di una piattaforma POCT per la misurazione di immunosoppressori in pazienti trapiantati. Qual era l’obiettivo del vostro lavoro e quali i risultati ottenuti?
Il progetto europeo Nanodem, da noi coordinato e costituito da un consorzio di nove partner provenienti da Germania, Regno Unito, Spagna e Portogallo, si è concluso a dicembre dello scorso anno; il progetto aveva come obiettivo la realizzazione di una piattaforma ottica in grado di misurare a fianco del letto del paziente e il più rapidamente possibile la concentrazione degli immunosoppressori somministrati nelle ore immediatamente successive al trapianto. In questa classe di pazienti uno degli aspetti più critici è il corretto dosaggio di tali farmaci, che hanno il delicato compito di evitare le crisi di rigetto dell’organo trapiantato, mediante una parziale inibizione della risposta del sistema immunitario. Se da una parte l’abbassamento delle nostre difese immunitarie è necessario perché il nostro organismo accetti un organo esterno, una eccessiva somministrazione di tali farmaci può avere pesanti effetti collaterali tali da mettere a serio rischio la vita del paziente; è stato inoltre dimostrato che la finestra di dosaggio di tali farmaci è estremamente stretta e varia da paziente a paziente. Attualmente il protocollo seguito si basa sulla misura della concentrazione degli immunosoppressori immediatamente prima di una loro somministrazione (generalmente effettuata ogni ora) mediante il prelievo e l’invio del campione presso un laboratorio centralizzato. La possibilità di effettuare una rilevazione più frequente, utilizzando una strumentazione vicino al letto del paziente, rappresenterebbe un notevole passo in avanti fornendo un aiuto estremamente importante per l’individuazione in tempi rapidi della corretta terapia.

Come funzionerà in concreto la piattaforma che avete sviluppato?
La piattaforma sviluppata nell’ambito del progetto e attualmente in fase di ulteriore sperimentazione consentirà la misura singola o combinata di tre degli immunosoppressori più utilizzati nei pazienti trapiantati: ciclosporina, tacrolimus e acido micofenolico. Tale piattaforma utilizza un catetere da microdialisi intravascolare, in grado di estrarre continuamente un campione biologico dializzato contente la frazione libera degli immunosoppressori circolanti nel sangue. Questo campione viene quindi inviato alla piattaforma ottica all’interno della quale si trova un chip a dieci microcanali: su ognuno dei microcanali è realizzato un strato sensibile che permette di determinare la concentrazione del particolare immunosoppressore mediante un saggio di tipo immunochimico utilizzante anticorpi come elementi di riconoscimento molecolare. Più specificatamente gli anticorpi vengono immobilizzati sulla superficie di nanoparticelle con proprietà sia fluorescenti che magnetiche, che sono quindi in grado di legarsi o con l’immunosoppressore presente nel campione biologico o con lo strato sensibile opportunamente realizzato; la caratteristica fluorescente delle nanoparticelle consente di associare al segnale di fluorescenza rilevato dalla piattaforma la concentrazione degli immunosoppressori, mentre il fatto che le nanoparticelle abbiano anche proprietà magnetiche consente di velocizzare la preconcentrazione delle nanoparticelle in prossimità dello strato sensibile, facilitandone quindi l’interazione e diminuendo il tempo necessario per effettuare una loro misura.

State già realizzando degli studi clinici?
È al momento in corso presso l’Ospedale della Technical University di Monaco, partner del progetto, uno studio clinico finalizzato alla verifica dell’importanza della misura della frazione libera degli immunosoppressori in pazienti in terapia intensiva, che consentirà di verificare su campioni clinici le potenzialità della piattaforma realizzata nel progetto europeo. È importante sottolineare, infatti, che quella che viene attualmente misurata è la concentrazione totale degli immunosoppressori costituita dalla frazione libera circolante, dalla frazione legata a proteine e dalla frazione intracellulare, mentre il parametro clinico di interesse sembra essere costituito proprio dalla frazione libera circolante. La nostra piattaforma sarebbe l’unico dispositivo al momento esistente in grado di effettuarne la misura accanto al letto del paziente.

La sepsi è l’altra patologia sulla quale avete e state lavorando. Qual è il vostro contributo per combattere questa che è la prima causa di morte nei pazienti in terapia intensiva?
Anche in questo caso stiamo sviluppando sempre nell’ambito di un progetto europeo, coordinato dal Leibniz Institute of Photonic Technology di Jena in Germania (Hemospec), una piattaforma POCT in grado di effettuare in tempi relativamente veloci (15-20 minuti) la misura simultanea di quattro differenti biomarcatori della sepsi: la proteina C reattiva (CRP), la procalcitonina (PCT), l’interleuchina 6 e il recettore solubile per l'urochinasi (suPAR). Come nel caso degli immunosoppressori, anche nel caso della sepsi è essenziale fornire ai medici dei dispositivi che consentano loro una diagnosi in tempi brevi così da predisporre rapidamente la terapia più opportuna. È importante sottolineare come oltre ad essere la causa più elevata di mortalità in pazienti in terapia intensiva, la sua corretta diagnosi in tempi rapidi risulti cruciale per la sopravvivenza del paziente: è stato recentemente dimostrato che, nel caso in cui la sepsi sia di tipo batterico e non virale, ogni ora di ritardo nella somministrazione di una efficace e corretta terapia antibiotica aumenta la mortalità nei pazienti in terapia intensiva di un fattore pari al 7%.

Come funziona questa piattaforma?
La piattaforma realizzata utilizza come campione biologico il siero ottenuto da sangue intero prelevato dal paziente e necessita di un volume di 500 microlitri di campione per effettuare la misura. Come nel caso degli immunosoppressori, anche qui elemento essenziale è un chip a tredici canali. Ciascun microcanale viene chimicamente modificato in modo da poter effettuare al suo interno un saggio biochimico, di tipo sandwich, che utilizza due diversi anticorpi uno dei quali marcato con un fluoroforo, aspetto questo che consente di procedere ad una rivelazione ottica del biomarcatore. La struttura a 13 canali permette di studiare fino a 4 biomarcatori con la possibilità di ripetere tre volte la rivelazione dello stesso analita. Il progetto che terminerà nell’aprile del 2018, prevede una valutazione clinica presso gli ospedali di Jena e di Atene che prenderà inizio nel mese di agosto e che prevede la misura su 120 pazienti nell’ospedale di Jena e di oltre 200 pazienti nell’ospedale di Atene.

State lavorando anche allo sviluppo di un sensore di fibra ottica per la misura simultanea di bile e pH nell’apparato gastroesofageo. Si parla di reflusso gastrico, insomma, una patologia molto diffusa. A che punto è questo progetto?
Questo progetto prevede la realizzazione di un sensore ottico portatile e alimentato a batterie in grado di misurare contemporaneamente bile e pH, due parametri importanti per una corretta diagnosi e la pianificazione della terapia più opportuna nelle patologie da reflusso. Si tratta in questo caso di una misura di tipo invasivo effettuata mediante un catetere a fibre ottiche posizionato all’interno dell’apparato gastroesofageo attraverso la cavità nasale. Mentre per la misura della bile, il principio è lo stesso dello strumento Bilitec utilizzante la bilirubina come marcatore della presenza della bile, per la misura di pH si utilizza un indicatore acido-base che una volta immobilizzato su granuli di quarzo porosi è in grado di variare il proprio assorbimento su tutto l’intervallo di interesse clinico, compreso ta 2 e 8 unità pH. La misura del pH avviene mediante l’utilizzo di due sole fibre ottiche e la sonda realizzata è coperta da un brevetto CNR esteso in Europa e negli Stati Uniti. Entro la fine dell’anno sono previste le prime prove su pazienti presso l’ospedale di Careggi. Si tratta di un progetto sostenuto economicamente dalla Regione Toscana svolto in collaborazione con il Dipartimento di Chirurgia e Medicina Traslazionale dell’Università di Firenze e la ditta Cecchi srl.

State lavorando anche alla progettazione e allo studio di nanoprodotti ottici intracellulari per la rilevazione di parametri chimici e biochimici all’interno delle cellule e per applicazioni cosiddette teranostiche (terapia e diagnostica) per il cancro. Ci può spiegare meglio di cosa si tratta?
Si tratta di un’attività di ricerca volta alla progettazione di nanosonde fluorescenti in grado di penetrare all’interno delle cellule e di modificare le proprie caratteristiche di emissione in seguito alla interazione con parametri presenti a livello cellulare. Nello specifico la sonda è il cosiddetto faro molecolare, una sequenza olegonucleotidica che è strutturata in maniera tale da emettere fluorescenza solo in presenza della interazione con uno specifico bersaglio. Il bersaglio da noi preso in esame è l’RNA messaggero legato alla produzione di survivina. La survivina è una proteina prodotta in eccesso nelle cellule tumorali, e questa sovrapproduzione – scientificamente parlando sovraespressione - induce una più o meno marcata inibizione del processo di apoptosi con la conseguente proliferazione incontrollata delle cellule.

Come funzionano queste sonde?
Queste sonde molecolari hanno una duplice caratteristica: da una parte quella di “accendersi” in presenza di RNA messaggero, rivelandone la sua presenza a livello intracellulare, dall’altra, legandosi ad esso, di bloccarne la produzione di survivina, agendo quindi come agente terapeutico antitumorale. Di qui le proprietà teranostiche di questi fari molecolari, cioè proprietà allo stesso tempo diagnostiche e terapeutiche. Le problematiche non indifferenti legate a questa ricerca sono legate, oltre alla progettazione ottimale del faro molecolare, alla sua internalizzazione all’interno delle cellule, dal momento che le sequenze oligonucleotidiche non sono in grado di per sé di oltrepassare la membrana cellulare: si tratta quindi di progettare opportune nanostrutture in grado di veicolare tali sonde all’interno delle cellule. Quello che noi stiamo utilizzando sono nanoparticelle polimeriche (più specificatamente nanoparticelle di polimetilmetacrilato), sviluppate da un Istituto CNR di Bologna, ISOF, sulla cui superficie sono stati immobilizzati i fari molecolari. In questo modo siamo riusciti a veicolare all’interno di linee cellulari tumorali queste sonde fluorescenti e ne abbiamo vericato le proprietà sia sensoristiche che terapeutiche. Il prossimo passo previsto è quello di verificarne la funzionalità su modelli animali, con l’obiettivo finale molto ambizioso e al momento ancora lontano, di una loro applicazione su pazienti.

Chiudiamo con un giudizio sull’attività della Regione Toscana sul fronte delle life sciences. Voi avete collaborazioni aperte in vari Paesi, ma come giudica il lavoro che si sta facendo nel nostro territorio?
Il giudizio è estremamente positivo; il territorio toscano è ricco di competenze non solo a livello accademico e di ricerca ma anche a livello industriale, dove accanto a realtà importanti (Menarini, Glaxo, Biomérieux, El.En. e Colorobbia, solo per citarne alcune) esiste un tessuto di piccole e medie imprese operanti nel settore che possono sicuramente beneficiare di un’attività di ricerca nel settore biomedicale e in particolare della biofotonica. E il Distretto Toscano Scienze della Vita è sicuramente il contenitore per eccellenza di tutte queste competenze. Non è un caso che una delle cause che ha portato alla formazione del nostro gruppo è stata la collaborazione vincente agli inizi degli anni Novanta con la Cecchi srl (allora chiamata Prodotec) una piccola/media azienda del panorama fiorentino che ha creduto nella nostra ricerca, collaborazione che ha portato alla commercializzazione del sensore per la bile. E non è un caso che la Regione Toscana ha indicato la fotonica, di cui la biofotonica è una parte importante, tra le sue priorità tecnologiche su cui investire. Sta a noi ora mettere a frutto questi investimenti, non limitandosi solo ad arrivare alla realizzazione di semplici prototipi da laboratorio ma impegnandosi a rendere questi prototipi operativi sul campo, aspetto essenziale per un loro reale trasferimento industriale.

Categoria: News

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